1. Ferritin a příprava apoferritinu
Ferritin je protein a byl objeven v roce 1937 Laufbergerem, který jej izoloval z koňské sleziny a zjistil, že obsahuje až 23 % železa [1]. Molekuly ferritinu jsou obsaženy ve většině živých organizmů a slouží k uskladnění iontů železa v podobě hydratovaných hydroxid-oxidů železitých. Zabrání se tak toxicitě, která by byla způsobena tvorbou volných radikálů při redukci železitých iontů na ionty železnaté. Jsou známy dva druhy ferritinů, a to maxiferritiny a miniferritiny. Tyto ferritiny mají rozdílné vnější a vnitřní rozměry a molekulové hmotnosti. Maxiferritiny se skládají z 24 polypeptidových jednotek, mají vnější rozměr 12 nm, dutina je o průměru 8 nm a molekulová hmotnost je 480 kDa (Obr. 1). Miniferritiny jsou pak složeny ze 12 polypeptidových jednotek s vnějším rozměrem 8 nm, průměrem dutiny 5 nm s hmotností 240 kDa. K výzkumným účelům se většinou používají maxiferritiny. Ty jsou komerčně dostupné a jejich schopnost reverzibilně skladovat a uvolňovat ionty železa upoutala značnou pozornost vědců [2,3].  

 

Apoferritin se připraví z ferritinu redukčním rozpouštěcím procesem za použití thioglykolové kyseliny nebo dithioničitanu. Dialýza za přídavku některého z redukčních činidel se opakuje, dokud se nezíská žlutý roztok apoferritinu. Tato výměna iontů je umožněna přítomností 14 kanálků ve struktuře apoferritinu, z nichž je šest hydrofobních a osm hydrofilních.

 

2. Jak lze využít apoferritin?

Apoferritin v syntéze částic
Důležité je, že apoferritin je schopen ve své dutině uskladnit i další ionty a změnou vlastností prostředí je uvolnit. Pro syntézu nanočástic uzavřených v apoferritinu se využívá kanálků ve struktuře apoferritinu, které slouží pro plnění dutiny proteinu reaktanty. Postupným přidáváním jednotlivých chemických látek je řízen průběh reakce [4]. V tomto případě je apoferritin využit jako nanoreaktor (Obr. 2).

 

Apoferritin jako nosič syntetizovaných částí
Druhou možností syntézy je využití rozevření struktury při nízkém pH, kdy se k polypeptidovým jednotkám v roztoku následně přidá látka, kterou chceme do apoferritinu uzavřít. Přídavkem roztoku hydroxidu se docílí zvýšení hodnoty pH, kdy se dostane požadovaná látka dovnitř apoferritinové struktury. Poté následuje dialýza, kdy se odstraní přebytek látky vně apoferritinu.

 

3. Využití v zobrazování a medicíně, další možnosti

Zobrazování
Apoferritin skýtá velké možnosti pro přípravu široké řady materiálů, které mohou být použity nejen v medicíně, ale rovněž pro elektronické aplikace. Pro účely zobrazování byly v apoferritinu připraveny kvantové tečky např. CdS, CdSe, ZnSe a tečky PbS s detekcí emisního spektra v blízké infračervené oblasti. Komplexy lanthanoidů uzavřené v apoferritinu byly pro změnu studovány jako kontrastní látky pro zobrazování magnetickou rezonancí.

 

Šetrnější léčba
Apoferritin lze rovněž použít k uzavření protinádorových léčiv, jako jsou cisplatina, karboplatina, oxaliplatina nebo epirubicin a doxorubicin. Další velkou výhodou apoferritinu, kterou lze využít pro transport léčiv, je možnost modifikace jeho povrchu. Povrch apoferritinu může být modifikován biotinylem, protilátkou nebo dalšími organickými a anorganickými činidly. Dále je možné využít spojení biotinu a streptavidinem modifikované superparamagnetické částice a transportovat apoferritinové komplexy do požadované tkáně pro zobrazovací nebo léčebné účely vnějším magnetickým polem (možnost využit v teragnostice, novém oboru kombinujícím diagnostiku a terapeutický zásah).  Modifikace umožňují využití pro transport uzavřených léčiv k cílovým buňkám mnohem efektivněji s minimalizací vedlejších účinků, zvláště pak toxicity vůči necíleným orgánům.

 

Předmětem našeho vynálezu je efektivnější příprava nanočástic biomolekul, markerů nebo léčiv se zvýšeným obsahem aktivní látky v apoferritinu pro diagnostické, zobrazovací a medicínské účely za použití apoferritinu a modifikace připravených komplexů pomocí látek schopných vytvářet další vazby. Takto upravené komplexy mohou být dále navázány na nosič, který umožní cílený transport v živém organismu.

 

Spojení modifikované apoferritinové molekuly s magnetickou nanočásticí (MNP) poskytuje velké možnosti využití. Spojení MNP, tvořené superparamagnetickými nanočásticemi Fe2O3 nebo Fe3O4 pokrytými streptavidinem, s apoferritinem je možné vazbou biotin – streptavidin, kde biotin je navázaný na apoferritinu.

 

Cílený transport je umožněn jednak použitím vnějšího magnetického pole a směřováním do místa působení nebo se mohou na povrch apoferritinu s enkapsulovanými částicemi navázat specifické protilátky (proti buněčným povrchovým antigenům) potřebné v místě působení.

 

 

Nanočástice doxorubicinu a ellipticinu připravené způsobem podle vynálezu, případně s vhodně modifikovaným povrchem, s navázanou protilátkou či vazbou na magnetické částice lze výhodně použít pro detekovaný transport léčiv na potřebné místo v organismu a využití v chemoterapii či jiné oblasti léčby. Apoferritinové komplexy mohou nalézt široké uplatnění ve výzkumu, diagnostice a medicíně a ve farmaceutickém průmyslu.

Objev i tento článek jsou společným dílem tria ve složení Vojtěch Adam, René Kizek a Pavel Kopel, všichni z MU Brno.

 

Literatura
[1] M. Laufberger, "Crystallization of ferritin", Bull. Soc. Chim. Biol., 1937, pp. 1575-1582.
[2] E.C. Theil, "Ferritin protein nanocages use ion channels, catalytic sites, and nucleation channels to manage iron/oxygen chemistry", Curr. Opin. Chem. Biol., 2011, pp. 304-311.
[3] E.C. Theil, R.K. Behera and T. Tosha, "Ferritins for chemistry and for life", Coord. Chem. Rev., 2013, pp. 579-586.
[4] M. Uchida, S. Kang, C. Reichhardt, K. Harlen and T. Douglas, "The ferritin superfamily: Supramolecular templates for materials synthesis", Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj., 2010, pp. 834-845.