Hlavní roli v příběhu hraje pivní kvasinka (Saccharomyces cerevisiae)…

Lékařský výzkum už není, co býval. Když se někdo zajímal o močové kameny, stačilo k tomu sledovat klíčová slova: člověk, ledviny, urolitiáza a nic mu neuteklo. A dnes? Kdo vynechá třeba jen králičí TRP kanály na kvasinkách, už není in.

Proč kvasinky?

Protože se s nimi dá poměrně dobře domluvit. Když se jim příslušný gen dá šetrně a do míst, kde jim to nevadí, nereptají a do své membrány zapracují i proteinovou strukturu, která nás zajímá. Další výhodou je, že jejich tělesná schránka je jednoduchá a na zkoumaném objektu je mnohem méně jiného proteinového balastu, který by zkoumání molekuly jen komplikoval a výsledky zapleveloval falší.

Proč králíci?

I když studie, o níž bude řeč, králíky zmiňuje, výzkumníci je tentokrát netýrali. Ve skutečnosti se žádný králík pokusu neúčastnil a jejich zásluha na objevu je prakticky nulová. Do spolupráce se připletli jen proto, že evoluci se nějak podařilo vytvořit dokonalý TRPV5, a tak s ním prakticky přestala experimentovat. Kvůli tomu, čemu genetici říkají vysoká homologie, bylo pro účely studie prakticky jedno, zda kvasinky nutili tvořit v membráně kousek hlodavce, nebo člověka.

Co znamená „TRP“?

… jen je poněkud vylepšená, aby se jí v membráně tvořil protein, který je v ledvinách zodpovědný za filtraci vápníku z moče.

I když je řeč o nemoci, při níž ti, co měli tu čest se s ní blíže seznámit tvrdí, že bolestí by člověk lezl po zdi, s utrpením to nemá nic společného. TRP je zkratka z anglického „transient receptor potential“. Další písmeno „V“ znamená, že jde o  vaniloidní receptor. Číslovka „5“ značí, že receptor je pátého typu. Převedeno do lidštiny: Jde o dírky v membráně, které propouští vápník. Nejsou to ale obyčejné dírky. Jsou to kanálky, které se dovedou uzavírat a otevírat a řídit tím koncentraci Ca2+ iontů na jedné, či druhé straně membrány.

Jak s tím souvisí ledviny?

Bez ledvin se neobejdeme. Je to naše čistička odpadních vod. I když jsou velké jen jako pěst, denně přefiltrují okolo 150 litrů krve a odstraní z ní odpadní látky. Zbaví nás jich ve formě cca jednoho až dvou litrů moče. Jednu z hlavních technologických rolí v tomto důmyslném zařízení zastává protein nazvaný  TRPV5. Vyskytuje se v hojné míře v epitelu  vrcholové části nefronů a má na starosti přechod vápenatých iontů z primární moče zpět do krve. Špatná funkce proteinu přivodí zvýšenou koncentraci vápníku v moči a často i s tím spojené radosti z ledvinových kamenů. Počty nemocných s konkrementy v močovém ústrojí v poslední době v ekonomicky vyspělých zemích strmě rostou. Po nespecifické infekci ledvin a močových cest je nefrolitiáza již druhým nejčastějším urologickým onemocněním. Postihuje jednu až tři osoby ze sta. U mužů bělošské populace některé studie uvádí incidenci až 12 %. Litiáza má navíc jednu nectnost, ráda se vrací.

Nefron - základní stavební a funkční jednotka ledviny. V každé ledvině jich máme přibližně jeden milion. Ke zpětné resorpci vápníku dochází v jeho proximální části. Právě tam se hraje o koncentraci vápníku v moči a rozhoduje o tom protein nazvaný TRPV5.

Architektura

To, co je podstatou článku, který před několika dny vyšel v recenzovaném časopisu Nature Structural and Molecular Biology, je popis architektury kanálku, konformace proteinové molekuly s jejími doménami. Tedy to, co jsme v našem povídání zatím zcela pominuli. Ono to totiž nám laikům neřekne zhola nic. Důležitější je, že se ke kýženým strukturám vědci dobrali látkou  econazole a metodou cryo-EM.

Co je cryo-EM?

O elektronových mikroskopech se dlouho soudilo, že jsou dobré tak akorát ke zkoumání neživé hmoty. Elektronový paprsek totiž biologický materiál ničí. Navíc tyto mikroskopy pracují ve vakuu, což biomolekulám rovněž nesvědčí. Obsahují vodu a ta když se vypaří, zkoumaný objekt se zhroutí.

Švýcar Jacques Dubochet přišel na myšlenku preparáty zmrazovat. Když se to provede dostatečně rychle (třeba ponořením do tekutého dusíku) krystalky vody se vytvoří tak rychle, že nestihnou vyrůst velké a biologický materiál neroztrhají. Hluboce zmrazené vzorky dokonce nějakou dobu ustojí i vakuum.

Joachim Frank, Američan narozený v Německu zase ukázal, jak nezřetelné dvojrozměrné obrazy analyzovat a sloučit, aby výsledkem byly ostré trojrozměrné struktury.

Kryoelektronová mikroskopie ve spojení s výpočetní technikou dokáže vyprodukovat kreslené obrázky s naznačenou trojrozměrnou strukturou proteinu. Uzavřený iontový pór má v tomto případě průměr méně než 7A. Tím se stal pro kulovitou strukturu vápníkového iontu (Ca2+) neprostupným. Zpětná resorpce se zastavuje a na budoucí problém je zaděláno. (Kredit: Hughes, Case Western Reserve University, 2017)

Brit Richard Henderson posunul techniku generování trojrozměrného obrazu proteinů ještě dál. Získal rozlišení na úrovni atomů. Všemu dohromady se teď říká kryoelektronová mikroskopie a v loňském roce (2017) se za ní všichni tři jmenovaní podělili o Nobelovu cenu za chemii.

Touto metodou se nyní podařilo získat trojrozměrný obraz proteinové struktury TRPV5. A protože to bylo v detailech jednotlivých atomů, získali jsme představu, jak v membráně řeší propustnost či uzavřenost otvoru. Tím, že výzkumníci použili při kultivaci buněk ekozanol, se podařilo zjistit i vazebná místa měnící proteinovou konformaci.

Co je econozale?

Není to nic zvláštního. Je to účinné antimykotikum a ženy ho dobře znají. Přípravek Ekozanol je zbavuje nepříjemných kandidóz. Poševní infekce ale tentokrát necháme stranou. Zmíněná molekula se ukázala být také účinným inhibitorem nyní zkoumaného proteinu TRPV5.

Zvětšit obrázek

Močový kámen o velikosti 8 mm. Zhruba 80 % konkrementů je z vápenatých solí. Obvykle vytvářejí kalcium oxalátové, či méně obvykle kalcium fosfátové konkrementy. Autor: Robert R. Wal, Wikipedia

Jinak řečeno, pokud tato látka obsadí na proteinu jeho vazebné místo, část kanálu se uzavře. Děje se to způsobem, který tak trochu připomíná zavírání clony na starých fotoaparátech, které se říká irisová. V poloze „zapnuto“ se tím membrána ledvinových tubulů stane pro vápník nepropustná. Protože se tak děje v místech rozhodujících o zpětné resorpci, výsledkem je nárůst koncentrace vápenatých iontů v moči. Z pohledu tvorby močových kamenů to nevěstí nic dobrého.

Psáno pro ALFA MEDICAL a osel.cz

Závěr

Strukturu proteinu TRPV5 již známe. Známe i strukturu ekozanolu i jakou částí své molekuly a na jaké místo se v proteinu váže. Znám je i mechanismus uzavírání kanálu. To vše dohromady dává představu, jaké látky hledat, aby pracovaly v opačném gardu. Vědci jsou přesvědčeni, že už jim jsou na stopě a že prostřednictvím molekulárních senzorů bude možné rizikovým osobám jejich uzavřené kanálky odblokovat, obnovit propustnost membrány nefronů a bránit vzniku patofyziologickým stavům. To je jistě dobrá zpráva pro nás všechny. Dvojnásob pak pro ty, kteří to potěšení s urolitiázou už měli. Četnost recidiv se totiž uvádí až 50 % a v některých studiích až 80 %.

Literatura

Taylor E. T. Hughes, et al.: Structural basis of TRPV5 channel inhibition by econazole revealed by cryo-EM. Nature Structural & Molecular Biology (2017). DOI: 10.1038/s41594-017-0009-1

Proteinovou sekvenci TRPV5 si ke svým hrátkám vybrali už i umělci. Říkají si Genové hudební studio. „Skladbu“ TRPV5 si lze poslechnout na adrese https://youtu.be/ir4fHJ36aEs

Dodatek

Uznání s přáním dalšího rychlého pokroku v „ ledvinové kamenologii“ patří nejen prvnímu autorovi  Tayloru E. T. Hughesovi z Case Western Reserve University v Clevelandu (stát Ohio), ale i mnoha dalším. Například Kevinu Huynh z University of California v Los Angeles, kde provedli velkou část snímkování. Stejně tak fyziologovi Johnu Del Rosario z Rutgers University, Newark, NJ, USA. Abhijeet Kapoorovi Aysenur Yazicimu z Icahn School of Medicine v Mount Sinai (stát New York). Seungil Hanovi z Pfizer Research z Grotonu (Connecticut). Farmakoložce Věře Y. Moiseenkové-Bellové z University of Pennsylvania a celé řadě dalších.