Zvětšit obrázek

Obr. 1: A) Expresní kazeta s vlásenkovou RNA. Na začátku je kuřecí U6 promotor (část regulující expresi genu), následuje vlastní vlásenka a poté hepatitidový ribozom, který má přesně odštípnout konec vlásenky. B) Struktura vlásenkové RNA, včetně vyznačení párování basí. D5 je vlásenka, na kterou se váže virová polymerasa, D7 je zmutovaná vlásenka, která slouží jako negativní kontrola. C) Aktivita virové polymerasy v kuřecích embryonálních buňkách v případě exprese žádné vlásenky (pLentilox), vlásenkové RNA (Decoy 5) a zmutované vlásenky (Decoy 7). Dále v buňkách připravených z transgenních (TG-D5) a netransgenních (Non-TG) kuřecích embryí.Kredit: Lyall, Science

Zemědělci již od pradávna upravovali plodiny i zvířenu, které nacházeli v přírodě. Získávali tím cenné znalosti, které jim zpětně pomáhaly při selekci, pěstování a chovu. Dlouhá tisíciletí čisté empirie ne tak dávno - v 19. století - doplnily pravidla formulovaná Mendelem. Po objevu mutagenních účinků radioaktivního záření se toto začalo hojně využívat pro vyvolání větší frekvence náhodných změn v genomu. Některé z nich se projeví změnou sledované vlastnosti. Když ji považujeme za pro nás výhodnou, takového mutanta cíleně rozmnožujeme. Každoročně se na trhu objeví celá řada takto vyšlechtěných odrůd a potraviny vyrobené z radiomutantů všichni jíme, aniž bychom si to uvědomovali.
Nyní máme v rukou nástroj umožňující docílit potřebných změn rychlejším způsobem. Ten se ovšem řadě lidí nelíbí. Zatímco v medicíně biotechnologie v podstatě nikomu nevadí (viz třeba Humulin alias lidský insulin produkovaný v bakteriích), pokud jde o zemědělství či dokonce potraviny, je oheň na střeše.

Zvětšit obrázek

Tak tito pašáci sice na ptačí chřipku stále umírají, ale jsou natolik sobečtí, že ji ostatním neposkytnou. Zdá se, že jim další nohy ani hlavy nerostou, přestože jsou transgenní… Kredit: Enserink, Science

Neptačí kuřata
Ač by se to po mediální hysterii s prasečí chřipkou nemuselo zdát, vědci se zabývají stále i chřipkou ptačí, neboť přetrvává riziko, že by se mohla vrátit. Po rekombinaci s jiným kmenem chřipky by mohla být ještě nebezpečnější. Chřipkové viry typu A (tj. ty, které se každoročně vrací a občas způsobí pandemii) obsahují 8 jednovláknových molekul RNA, které kódují 11 genů. Pokud se někdo nakazí dvěma (či dokonce více) různými kmeny, mohou se v jeho buňkách jednotlivá vlákna RNA náhodně poskládat do nového viru. Tak vznikají nové, potenciálně nebezpečné subtypy chřipek. Ty se označují podle proteinů hemaglutininu a neuraminidázy, které jsou na povrchu viru a proto je imunitní systémem může rozpoznávat.

Kontrola rozšíření virů ptačí chřipky v divoké populaci je obtížná a nepraktická, zato v domestikovaném chovu je snáze proveditelná. Nicméně v současnosti používané vakcíny nedokážou navodit úplnou imunitu ani proti subtypům virů, proti kterým byly navrženy. Navíc chřipkové viry často rekombinují a mutují, což představuje další výzvu.
Vědci a vědkyně z Velké Británie proto navrhli vlásenkovou RNA (smyčka uzavřená dvěma sekvencemi, které se vzájemně váží, viz obr. 1A), která slouží jako návnada pro virovou polymerázu. Ta pak, místo aby replikovala svůj vir, se na návnadu naváže, což zablokuje plnění její funkce. Při expresi takového systému v kuřecích  embryonálních buňkách byla aktivita virové polymerázy výrazně snížena (obr. 1).
Jak ukázaly pokusy, transgenní kuřata sice stále umírají, ale chřipkový virus se již dále nešíří (obr. 2). 10 transgenních a 10 netransgenních kuřat bylo virem chřipky cíleně nakaženo, pak rozděleno po pěti a chováno s dalšími 12 zdravými kuřaty různého transgenního statusu. Tak vědci vytvořili 4 skupiny. V těch, kde byla infikována původně netransgenní kuřata, všechna ostatní zemřela do 7 dnů. Pokud však infikovaná kuřata byla transgenní, skoro všechna ostatní by přežila, nebýt nevyhnutnosti provést histologická vyšetření. Žádné z nich neprokázalo přítomnost viru. To znamená, že při nákaze ve velkém chovu by zemřelo jen pár kusů a virus by neměl šanci způsobit pandemii.

Očkovací vakcíny bývají většinou specifické vůči jednomu kmeni a navíc i po očkování dochází k určitému přenosu viru mezi jedinci, takže ten může dále mutovat a rekombinovat se do nových typů. Oproti tomu tato strategie nabízí možnost, jak zabránit přenosu viru, který by tím pádem neměl možnost zmutovat. Navíc použitá vlásenková RNA napodobuje sekvenci všech osmi virových RNA molekul, na které se váže virová polymeráza, takže pokud by chtěl virus zmutovat, musel by zároveň zmutovat jak polymerázu, tak všech osm vláknech RNA, což je vysoce nepravděpodobné. Tato transgenní kuřata by teoreticky mohla snadno nahradit všechna kuřata ve velkochovech po celém světě, protože ty vlastní jen hrstka konsolidovaných společností. Problémem však jsou převážně domácí chovatelé v rozvojových zemích, kteří mají pár kuřat vzadu na dvorku, protože právě tady se výborně šířila ptačí chřipka a přeskakovala z ptáků na lidi. Takovým je třeba poskytnout transgenní kuřata, aby si je namnožili sami. Organizace OSN pro výživu a zemědělství nedávno upozornila, že se znovu začíná šířit ptačí chřipka, která zřejmě zmutovala, takže je odolná proti vakcíně. Na podzim a v zimě bychom tu mohli mít novou epidemii.

Kravské mléko s lidským proteinem

Zvětšit obrázek

Obr. 2: 10 transgenních (TG-D5) nebo netransgenních (Non-TG) kuřat bylo nakaženo virem chřipky (challenged), rozděleno na dvě skupiny (po 5 kusech) a chovány s 12 transgenními či netransgenními kuřaty (in contact) tvoříce 4 skupiny. Doba přežití jednotlivých kuřat je naznačena délkou zeleného pásu. Barva posledního políčka označuje den a způsob smrti (černá – nalezeno mrtvé; fialová – skomírající kuře zabité z etických důvodů; oranžová – zabito kvůli histologickému vyšetření). Jednotlivá čísla značí množství virové RNA v bukálních stěrech (v logaritmickém měřítku), případně negativní výsledek (-) nebo bez měření (*). Sloupec IHC vyznačuje výsledky histologického vyšetření: virus detekován (+); nedetekován (-) a netestováno (nt).Kredit: Lyall, Science

Debaty, zda kojit či radši dříve přejít na umělou stravu, trvají snad od první průmyslové produkce umělé stravy a doporučení odborníků se mění nikoli zřídka. Jisté je, že má mateřské mléko určité výhody. Obsahuje (kromě mnoha jiných) enzym lysozym, který se bohatě vyskytuje i v jiných tělesných tekutinách, jako jsou slzy nebo sliny. Plní funkci nespecifické imunity, protože štěpí buněčnou stěnu a tím omezuje bakteriální růst. Dokonce působí i proti virům (např. HIV) a plísním. Lysozym v mateřském mléku zvyšuje imunitu a zabraňuje infekcím, zřejmě díky lýze některých potenciálně nebezpečných gram-positivních a několika gram-negativních bakterií v zažívacím traktu dítěte. Typická koncentrace lysozymu v lidském mléku je 200 - 400 µg/ml, zatímco v mléku přežvýkavců je jeho obsah nízký. Kravské mléko obsahuje pouze 0,05 - 0,22 µg/ml lysozymu. A co hůř, kravský lysozym má zhruba desetkrát nižší aktivitu než lidský, to znamená, že celková lysozomální aktivita v kravském mléce může být řádově 10 000 krát nižší.

Občas se stane, že matka nemůže z různých důvodů kojit, i kdyby chtěla, proto je vhodné hledat alternativní zdroje lysozymu. Metody rekombinantních proteinů by mohly poskytnout přímo lidský lysozym. Mléčné žlázy byly navrženy jako vhodný zdroj rekombinantních proteinů již v minulosti, neboť jsou schopny zajistit vhodné  post‑translační úpravy a epitelové buňky okamžitě sekretují rekombinatní protein do mléka. Tím pádem se dá snadno vyčistit malým počtem chromatografických kroků. Takto byly již v minulosti produkovány v mléce např. pavoučí proteiny pro tvorbu vláken nebo různé nutričně významné bílkoviny. V případě rekombinatního lysozymu je navíc omezen růst bakterií v mléce, takže nedochází k mastitidě - zánětu vemene. Rekombinatní lysozym byl již produkován v mléčných žlázách myší a koz. Předchozí pokusy ukázaly, že takové mléko dokáže snížit množství bakterií v zažívacím traktu, včetně E. coli, což by se obzvláště dnes hodilo.

Zvětšit obrázek

Na Novém Zélandu probíhaly protesty proti transgenním zvířatům spíše emotivně. Ženy se obávaly, že bude jejich právo kojit ohroženo polidštěným mlékem. Kredit: Greenpeace

Nyní se rozhodla skupina čínských vědců produkovat lidský lysozym v kravském mléce a srovnat jeho vlastnosti s komerčně dostupným lysozymem. Výsledky, které publikovali v časopise PLoS ONE, u všech provedených pokusů (zjištění sekvence pomocí hmotnostní spektroskopie, měření aktivity, optimální teplota a pH) ukazují, že jsou vlastnosti obou proteinů stejné. Také složení mléka transgenních i netransgenních krav bylo podobné. Tento systém nabízí několik výhod. Takovéto transgenní krávy by se mohly stát zdrojem rekombinantního lysozymu, který by se buď čistil pro další použití, nebo byl konzumován přímo v mléce. Navíc by se tím u dojnic omezil vznik mastitidy a zřejmě by i zvýšil přirozenou trvanlivost mléka, jak se ukázalo v případě transgenních koz.

Bohužel zde již bylo několik pokusů, jak vylepšit kravské mléko, ale zatím vždy narazily na odpor veřejnosti. Často šlo spíše o emotivní argumenty, kdy ženy považovaly GM krávy za ohrožení kojení, místo aby je přijaly jako vhodnou alternativu. Zatím můžeme jen spekulovat, jak uspěje tento projekt, který poskytuje všechny dosavadní prospěchy v jednom.

Prameny:
Lyall J, Irvine RM, Sherman A, McKinley TJ, Núñez A, Purdie A, Outtrim L, Brown IH, Rolleston-Smith G, Sang H, Tiley L (2011) Suppression of avian influenza transmission in genetically modified Dickens; Science, 331(6014):223-6.
Enserink M (2011) Avian influenza. Transgenic chickens could thwart bird flu, curb pandemic risk. Science, 331(6014):132-3. http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatitis_delta_virus_ribozyme

Yang B, Wang J, Tang B, Liu Y, Guo C, et al. (2011) Characterization of Bioactive Recombinant Human Lysozyme Expressed in Milk of Cloned Transgenic Cattle. PLoS ONE, 6(3): e17593. doi:10.1371/journal.pone.0017593 http://en.wikipedia.org/wiki/Lysozyme