Zatímco Robertu G. Edwardsovi za jeho zásluhy při zvládnutí procesu zrání lidských vajíček a aplikaci techniky oplodnění ve zkumavce udělili Nobelovku...

Znaky podle kterých vědci dokážou nyní zjistit, zda se zárodek bude vyvíjet tak jak má, se objevují ještě předtím, než se začnou spouštět geny embryonálního vývoje. Z toho vyplývá, že embrya jsou zřejmě předurčena pro přežití či smrt ještě předtím, než dojde k prvnímu buněčnému dělení. Ale ať je tomu jakkoliv, pro klinická pracoviště je možnost získávat embrya s vyšší šancí na přežití požehnáním. Nejen, že zvyšuje naději otěhotnět, ale také snižuje riziko potratů. Zatím se k problému s malým počtem zdárně se vyvíjejících embryí přistupovalo tak, že se léčeným ženám „pro sichr“ aplikovalo  do dělohy oplozených vajíček více a kalkulovalo se s tím, že se všechna nevyvinou. Někdy to vyšlo, jindy ne, což je příčina vícečetných těhotenství a potratů. Obojí je rizikové samo o sobě i u zdravých žen, natož u těch, které se dlouhodobě léčí. Pro ně to může znamenat ztrátu poslední naděje.

Renee Reijo Peraová je profesorkou porodnictví a gynekologie na lékařské fakultě a vedoucí Centra lidských embryonálních kmenových buněk. Z její dílny nyní vyšla metoda, která rizika ženám podstupující in vitro fertilizaci snižuje. Její pracoviště je ve Stanfordu a ten je v Americe a tak je vůbec s podivem, že se jí k její práci podařilo lidská vajíčka sehnat. Obejít vládní nařízení se jí podařilo jen díky tomu, že se dostala k jakýmsi zbytkům, které zůstaly v Centru reprodukční medicíny při University of Minnesota z dob, kdy zákaz s nimi pracovat ještě neplatil. Šlo o vajíčka a embrya, která byla zmrazena v tekutém dusíku  a pocházela z léčebného programu prováděného Lutheránskou všeobecnou nemocnicí v Illinois. Mluvíme o době před rokem 2002. Základem in vitro fertilizace byla a je hormonální stimulace ženy a mnohočetná ovulace vajíček, která se z vejcovodu vyplachují a následně oplodňují  „ve zkumavce“. Protože se při každém takovém počinu většinou získá vajíček více než se upotřebí, přebytky se zmrazí pro případ, že by se otěhotnění napoprvé nepovedlo, aby se nemusela hormonální léčba a složitý akt odběru, který ženskému zdraví ani psychice nepřidá, opakovat. Někdy se stane, že přebytečných embryí se pár, který už další děti mít nechce, vzdá. Nikdo pak neví co s nimi  a klinice to zvyšuje náklady, protože jejich uchovávání ve zmrzlém stavu není zadarmo. Dnes již kvůli legislativním zákazům se zygoty k výzkumným účelům v USA takto získávat nesmějí. Tím, že šlo o „materiál starý“ deset a více let, justice na něj „nedosáhla“.  Naštěstí při zmrazení v dusíku (mínus 196 stupňů Celsia) žádné enzymatické procesy neprobíhají a po biologické stránce šlo o buňky stejně hodnotné, jako kdyby se získaly včera. Kolekce těchto „prošlých“ zárodků, u nichž nikdo nevěděl jak se jich legálně zbavit, se pro mladou Američanku stala zlatým dolem z něhož se podařilo vykutat výsledky, jež se nyní objevily v prestižním časopisu Nature Biotechnology. 

Článek pojednává o kultivaci více než dvou stovek rozmrazených lidských embryí. Přesněji zygot, protože šlo o buňky vzniklé z vajíčka krátce po jeho oplodnění, kdy ještě nedošlo k dělení buňky, ale co již někteří nazývají stadiem „jednobuněčného člověka“.  Dnes už se embrya nemrazí tak brzo po oplodnění (12 až 18 hodin)ale nechávají se kultivovat v laboratoři po dobu tří až pěti dnů. Během ní se provádí selekce těch, která podle výbírajícího mají větší šanci na zdárný vývoj. Teprve pak se embrya znovu setkávají se svou matkou a jde-li vše hladce, do porodu žijí společně.

Zvětšit obrázek

--- Renee A. Reijo Pera, profesorka porodnictví a gynekologie na Stanfordské universitě se potýká s nesmyslným legislativním zákazem. Přesto se jí daří posouvat hranice úspěšnosti přenosu lidských embryí směrem ke zdravým potomkům.

Křesťansky založená část veřejnosti došla v Americe k závěru, že výzkum na embryích je „špatnou volbou“ a postarala se o přijetí tzv. Dickey-Wickerova dodatku, který zakazuje, aby americký stát výzkum na lidských embryonálních buňkách financoval. To byla další rána, která se Peraové postavila do cesty. Embrya měla ale sebrali jí prostředky na provoz laboratoře. Naštěstí se našel neznámý dárce, který na její výzkum poukázal dost štědrou sumu. Práce s  rozmraženými embryi a testování toho co jim prospívá a co ne, mohlo pokračovat. V tomto výzkumu nejde o málo a i když to zatím nikdo neprokázal, mnozí embryologové si myslí, že během mimotělní (nefyziologické) kultivace se v embryu hromadí genetické změny, které mohou mít dlouhotrvající až trvalé následky.

A jak že to Američanka získaná embrya „trápila“?
Rozmrazila je a rozdělila do čtyř skupin. Pak je všechny nechala vyvíjet po dobu několika dnů. Se svými spolupracovníky je po celou dobu sledovali pomocí videokamery napojené na mikroskop. Zaznamenávali každý jejich „krok“, což jim později umožnilo se v čase vracet zpět a všímat si rozdílů u těch embryí, která se později ukázala být vadná, přestávala se dělit, nebo vykazovala jiné abnormality.
Počítačový mág Kevin Loewke sepsat program, který sám vyhodnocuje obrázky, sleduje embrya až do vývoje blastocysty (duté koule) a je schopen si všímat v tomto procesu charakteristických změn na buňkách, které se jim v dalších stádiích vývoje vymstí, vedou k abnormalitám a nebo zastavení jejich dělení. Počítač dokáže najít odlišnosti, kterých si lidské oko nevšimne, ale embryu zkomplikují život, někdy až šest dní po oplodnění.
Ze všech 242 jednobuněčných zygot v pokusu se při kultivaci po pěti až šesti dnech dařilo získat normálně vypadající blastocysty ve sto případech. O čem to svědčí? Že se vědci přiblížili tomu, čeho dosahuje sama příroda když se zárodek vyvíjí v lůně matky. To je důležité, protože z toho lze usoudit, že i embrya se v jejich laboratorních boxech cítila „jako v bavlnce“ a zákonitosti, které vědci yjistili nejsou jen něčím teoretickým, ale měly by mít platnost i v podmínkách in vivo.

VIDEO: Záznam vyvíjejících se patnácti lidských zygot. Jde o sekvenci jednovteřinových záběrů, které se spouštěly každých pět minut. Na záznamu je vše podstatné, co se v kultuře událo během šesti dnů. Poněkud matoucí je přeskupení buněk zhruba v polovině záznamu. Jde ale o následek výměny živného média, které po třech dnech kultivace muselo být vyměněno a to s buňkami poněkud zamíchalo. Deseti embryím se podařilo zdárně dosáhnout stadia blastocysty a pět z nich zůstalo uvězněno v nižších stádiích vývoje. 

Nyní k tomu podstatnému

Zvětšit obrázek

Série horních snímků představuje normálně se vyvíjející embryo. Sada obrázků uprostřed a dole představuje fragmentovaná embrya, která nemají šanci dát vznik zdravému lidskému plodu. Počítačový program je schopen odlišné charakteristiky vývoje rozlišit a provést selekci.

 Záznamy stovek embryí s možností porovnávat jejich úspěšný a neúspěšný vývin umožnily počítačovému programu odhalit nepatrný rozdíl v trvání první cytokinezy - posledním kroku buněčného cyklu nazývaného mitóza, kdy se buňka fyzicky dělí na dvě. Jako rozhodující věc o dalším osudu zárodku se ukázala být doba mezi první a druhou mitózou a synchronizace druhé a třetí mitózy. Tedy zda se první, mitozou vzniklé dvě buňky, dál dělí synchronně. Podle těchto kriterií lze již v průběhu prvních dvou dělení (tedy ve stadiu kdy má embryo čtyři buňky), což odpovídá stáří prvních dvou dnů vývoje od početí určit, jaký bude další osud zárodku.

Jaké úspěšnosti se tým Peraové při svém věštění dobral?
V programu lze například zadat, aby si všímal tří z důležitých parametrů a počítač prostřednictvím kamery sleduje jak jednotlivá embrya dodržují plán svých životních milníků. Embrya, která se „vejdou do příslušných časových oken“ se budou s 90 procentní jistotou vyvíjet normálně a jsou tedy schopné dát vznik „zdravé“ blastocystě schopné uhnízdit se v děloze a vyvinout se v nový život.

Zvětšit obrázek

Příklad zpracování obrazu počítačovým programem. Vlevo: Původní obrázek z mikroskopu v různých odstínech šedi. Uprostřed: obrázek po prvním zpracování a vpravo pak konečné křivky které počítačový program bere v úvahu při vzájemném porovnávání jednotlivých buněk.

Je pochopitelné, že výzkumníky zajímal také profil genové exprese jednotlivých buněk. Jinak řečeno to, kdy které geny se začnou probouzet. Ukázalo se, že zpočátku se do práce dávají geny z mateřského genomu (vajíčka a nikoli spermie) a že veškeré dění běží jen v režii matky. Až třetí den (ve stadiu osmi buněk) se začnou ozývat geny specifické pro embryonální vývoj. Jejich relativní podíl se v průběhu dalších dělení zvyšuje, ale ne všechny buňky se v chovají stejně. Některé stále lpí jen na mateřských příkazech, zatímco jiné spouští gejzír genů startujících diferenciaci embrya. Aktivita genů je jen jiný pohled na to, zda embryo jede podle plánu, nebo se na něčem zaseklo a má problém. 
Nevíme zatím proč, ale někdy se to tak semele, že si buňky v embryu jedou každá po svém. Jakoby se časově rozešly a pak spolu nejsou včas na správném místě (nesejdou se ve vymezeném časovém okně). K tomu dochází, když se buňkám nedaří včas spustit ničení příkazů z mateřské DNA. Tak trochu to připomíná něco, co už známe – má-li z dítěte něco pořádného vyrůst, přehnaná péče autoritativní matky je ku škodě. Podobně tomu je i na samém počátku našeho vývoje. Buňky, které despotickou matku nezavrhnou a dál jedou podle RNA transkriptů jejího genomu, začnou ve svém vývoji pokulhávat a stanou se hrozbou pro celé embryo.

I když se za pochopení procesu zrání lidských vajíček letos udělovala Nobelovka a oslavné texty svádějí k dojmu, jak jsme v tom dobří, ve skutečnosti jsme jen na samém začátku a u přírody se toho máme ještě hodně co učit. U myší se do stadia blastocysty daří dostat asi 80 až 90 procent embryí, u člověka je to jen 30. U embryí hlodavců je chromozomálně abnormální jedno ze sta, u lidí sedm z deseti. Dál zakazovat výzkum na lidských embryích je za této situace prakticky totéž, jako brát šanci dalším lidem mít zdravé dítě.

Prameny:
nature.com
Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1686