Zvětšit obrázek

Snímání signálu z YC3.60 optickým vláknem. Vlevo je schéma metody měření akčního potenciálu. Vpravo je několika sekundový záznam signálu z YC3.60 (aktivity neuronů) v mozku u volně se pohybující myši. Fialová barva vyznačuje dobu klidu, zelená pohyb, šedá dobu, kdy se myš svými fousky dotýkala podložky a prováděla „rekognoskaci terénu“. Černá křivka vypovídá o přítomnosti Ca2+ iontů v buňce (aktivitě neuronu). (Kredit: Mazahir T. Hasan)

Komunikace neuronů
Neurony přenášejí informaci ve formě podráždění, přičemž struktura, která to umožňuje, je speciální cytoplasmatická membrána. V buňce je jiná koncentrace různých iontů než v mezibuněčném prostoru a udržení tohoto stavu zajišťuje sodíko-draselná pumpa (ATPázová pumpa). U nervových buněk nerovnováha mezi ionty uvnitř a vně buňky vytváří membránový potenciál asi -50 až -90 mV. U vnitřního povrchu membrány se hromadí záporný náboj, u vnějšího náboj kladný. Zdrojem potenciálu jsou ionty, zejména K+, Na+, Cl- a anionty bílkovin.

Akční potenciál a šíření vzruchu
V klidu je na membráně membránový potenciál, membrána je tedy polarizována. I když se v souvislosti se šířením nervového vzruchu hovoří často jen o koncentracích iontů sodíku a draslíku, významným hráčem je i intracelulární vápník. Jeho ionty jsou elektrickou sílou přitahovány dovnitř, a protože jsou vně buňky ve větší koncentraci, působí na ně stejným směrem i chemická osmotická síla. Výsledný elektrochemický potenciál je pro ionty vápníku velký, membrána je pro ně však jen velmi málo propustná.  Když buňka začne přenášet informaci (akční potenciál),  vlna depolarizace membrány, která nastává otevřením iontových kanálů, se šíří postupně po povrchu neuronu a koncentrace vápenatých iontů v buňce vzroste. Právě toho využívá metoda vizualizace nervového vzruchu. Hlavní roli v tom hraje proteinový fluorescenční indikátor. Jde o barvičku složenou ze dvou podjednotek, přičemž jedna svítí oranžově, druhá modře. Když se na tento fluoreskující protein naváže vápník, jeho excitační barva přechází do modré. Barva se mění podle množství dostupných iontů vápníku v buňce. Podle schopnosti měnit barvu dostal protein přezdívku „chameleon“.

S novou variantou tohoto fluoreskujícího proteinu (YC3.60) se nyní vědcům podařilo zaznamenávat reakce nejen shluků neuronů, ale i jednotlivých nervových buněk. Změna barvy se projevuje prakticky okamžitě v závislosti na přítomnosti vápenatých iontů. To znamená, že metodou lze v reálném čase sledovat i sekvenci akčních potenciálů buněk (jejich průběžně se měnící reakce). 

Měření bez kovových elektrod
Až dosud se aktivita mozku dala měřit jen zavedením elektrod přímo do buněk a tam se jim snímal elektrický proud. Je zřejmé, že docházelo k poškození buněk a ty se pak nemusely chovat zcela normálně.  Navíc stará metoda neumožňovala pracovat s identitou jednotlivých buněk. Nová metoda využívající „chameleon“ je také invazivní technikou, ale nesnímá elektrický signál, nýbrž světelný a k tomu místo elektrody používá optické vlákno. Jednotlivou buňku, nebo nerv, lze tedy dnes již pozorovat poněkud „z povzdálí“, což znamená, že jde o mnohem šetrnější postup, než když se buňka napichovala kovovým drátkem. Světlovody jsou mnohem jednodušší, tenčí, levnější a k mozku šetrnější.

Blikající neurony nemá každý

Zvětšit obrázek

Akční potenciál neuronu lze stanovit podle optického signálu.

K tomu, aby neurony v době přenášení impulsu svítily musejí v sobě mít protein chameleon. Ten si buňka nevytvoří sama, ale musí ji k tomu přinutit molekulární genetik. K takovému vpašování cizího proteinu do buňky se použije „chřipka“. Nejde o virus nemoci v pravém slova smyslu, ale jen o jeho „vykuchanou“ formu, říká se jí vektor. V něm je „zlý“ obsah nahrazen jiným genetickým kódem, v tomto případě instrukcí pro tvorbu proteinu chameleon.  Ošetřené buňky si pak tvoří požadovaný protein samy. Když se na takto vybavený neuron vyšle foton, protein se excituje a odpoví v barvě, která odráží množství vápenatých iontů v cytoplazmě muňky.

Co je na tom nového?
Snímání potenciálu z buněk pomocí excitujícího proteinu není novinka, skupina Mazahira Hasana tuto možnost publikovala před několika lety. Již tehdy se hovořilo o významném posunu v možnostech sledování aktivity nervových buněk. Šlo ale o pokusy na buňkách pěstovaných v kultuře, nebo na mozcích zabitých zvířat.
Tentokrát již nejde o sledování buněk „na misce“ a o popis toho, co se stane, když k nim přidáme tu či onu chemikálii. Podle neurologů se jedná o skutečný milník, který dovoluje sledovat chování buněk v reálném čase, na živém, volně se pohybující zvířeti. Nejvíce si vědci slibují od možnosti zkoumat chování stále stejných buněk, na stále stejném zvířeti a po dlouhou dobu v řádech měsíců. To by jim mělo dovolit zjistit, jak se stejná nervová buňka chová poté, co mozek nabude nových zkušeností. Již začali sledovat neurony zapojené do vedení vzruchů od hmatových vousků, které jsou pro hlodavce k orientaci velmi důležité. Od každého z vousků vede cesta až do thalamu a kortexu, kde vzruchy pomáhají vytvářet „mapu“, podle které se zvíře v prostoru orientuje. Jde tedy o sledování základních mozkových pochodů, kterými zkušenost utváří vzory chování. Jsme tedy možná na prahu pochopení procesů formování paměti, vybavování si vzpomínek a možná i procesů, jakými mozek řeší výpadky celých okrsků šedé kůry, k nimž dochází například v důsledku stáří, nebo následkem úrazu, Alzheimerovy choroby,…

Video: Pohled do přemýšlejícího myšího mozku prostřednictvím proteinu senzitivního na vápník.

Video: Stimulace synapsí elektrickým šokem

Pramen: Max Planck Institute for Medical Research