Proteomika – zlatý důl budoucnosti
Po přečtení lidské dědičné informace vyvstal před biology další, podstatně složitější úkol. Jestliže genetici musí odhalit tajemství zhruba 35 tisíc genů, pak biology čeká vyčerpávající práce s odhalením funkce bílkovin, jež lidské tělo podle těchto genů vyrábí. Jejich počet se odhaduje na 200 tisíc až 2 miliony. Bílkoviny představují ve srovnání s geny o poznání problematičtější předmět výzkumu. Geny zůstávají prakticky stále stejné. Bílkoviny se neustále mění. Jsou jiné v každé tkáni, v každém věku. Mohou se změnit dokonce v závislosti na tom, co jíme, jestli pijeme alkohol nebo kouříme.


Proteomika je výpravou do úžasného světa proteinů

Hon na bílkoviny
Pro vědě o dědičné informaci jednotlivých organismů se už vžilo označení genomika. Podle tohoto „vzoru“ bylo vytvořen název pak pro nově vznikající vědní disciplinu, jež se zajímá o bílkoviny jednotlivých pozemských organismů. Říkáme jí proteomika. Protikladem genetického termínu genom (dědičná informace organismu) se stal proteom čili soubor všech bílkovin daného organismu.
„Právě proteomika přináší ovoce, které nám genomika nikdy nemohla poskytnout,“ tvrdí expert na proteomiku Sam Hanash z americké University of Michigan.
Před pár lety bylo slovo proteomika téměř neznámým pojmem. Dnes je tento vědní obor pro investory lákavější než počítačový průmysl.


Prostorový model proteinu, který se podílí na vzniku Alzheimerovy choroby

Zběsilost současného honu na bílkoviny vyplývá z faktu, že právě bílkoviny stojí ve středu veškerého dění v buňkách, tkáních i orgánech. Pokud nejsou bílkoviny v pořádku, neprobíhají životní děje v organismu tak, jak mají. Výsledkem jsou nejrůznější onemocnění, od celkem banálních až po tak závažné choroby, k jakým patří rakovina nebo Alzheimerova nemoc.
Proteomika v současné době láká k obrovským investicím. V letech 2000 až 2001 šlo do proteomiky 530 milionů dolarů přímých investic. Vznikají desítky nových firem, které vidí v tomto vědním oboru příležitost. Některé hledají nové nadějné proteiny a podobají se zlatokopům promývajícím zlatonosné písky Kalifornie nebo Aljašky. Další firmy vsázejí na taktiku obchodníků, kteří prodávali zlatokopům živobytí a náčiní. Obchod s vybavením proteomických laboratořích prosperuje přinejmenším stejně dobře jako samotná proteomika.
Pátrání po nových bílkovinách neignorují ani giganti farmaceutického průmyslu. Firmy jako GlaxoSmithKline nebo Pfizer spustily své vlastní proteomické výzkumné programy. Taktiky jsou různé, ale cíl mají všichni stejný – najít slibný protein a nechat si patentovat jeho praktické využití.


Stane se proteomika skutečně „zlatým dolem“? To ukáže teprve čas.

Není to ale tak jednoduché, jak se může zdát z prohlášení zástupců jednotlivých proteomických firem určených tiskovým agenturám. Zatím nikdo nedisponuje technologií, která by mu umožnila identifikovat slibné bílkoviny jako na běžícím pásu. „Snadných cílů“ není mnoho a vládne kolem nich pořádná tlačenice. Firmy nemají vyhráno, ani když už v jejich rozhozených proteomických sítích uvízne slibný protein. Dalším nezbytným krokem je vývoj látky, která ovlivňuje funkci bílkoviny žádoucím způsobem a působí jako účinný lék bez nežádoucích vedlejších účinků. Podnikání v oblasti proteomiky je krajně riskantní. Současná vlna proteomického nadšení nicméně nedovoluje polevit v enormním nasazení sil i financí nikomu, kdo se závodu při hledání nových bílkovin účastní. Každý má strach, že jeho zaváhání využije konkurence a získá rozhodující náskok.

Nesnadný cíl - bílkovina
Nově vzniklá vědní disciplina je plná nejasností. Experti se nedokážou pořádně shodnout ani na tom, co se vlastně skrývá za pojmem proteom. Už jsme si řekli, že by mělo označovat všechny bílkoviny, které se vyskytují v určitém organismu (bakteriálním, rostlinném nebo živočišném druhu). Jenže bílkoviny se nejednou chovají jako přeludy. Mizí a opět se objevují, proměňují se. Jsou všechno, jen ne stálé. To co se v jednu chvíli jeví jako proteom daného organismu, se vzápětí může změnit k nepoznání. Záleží nejen na tom, kdy se na proteom díváme, ale dokonce i na technikách, které pro jeho poznávání použijeme. „V genomice je to všechno jednoduché,“ vysvětluje Ruedi Aebersold, jeden z předních expertů v proteomice a spoluzakladatel proteomické firmy Systems Biology sídlící v americkém Seattlu. „Cílem genomiky je získat kompletní pořadí všech písmen genetického kódu v dědičné informaci daného organismu. V proteomice se ale snažíte chytit do ruky podstatu procesů v živém organismu v celé jeho dynamice.“
Na čtení dědičné informace lze použít univerzální technologii. Dnešní genomice vládnou moderní robotické sekvenátory, které jsou na jedné straně „krmeny“ vzorky dědičné informace a na druhé straně z nich „leze“ více méně souvislá řada písmen genetického kódu.


DNA sekvenátor vnesl revoluci do genomiky. Proteomika na něco podobného zatím jen toužebně čeká.

Data z jedné laboratoře lze relativně snadno kombinovat s daty získanými jinými týmy. Soukromá genomická korporace Celera Genetics, která této oblasti výzkumu vládne, čerpala při čtení lidské dědičné informace z výsledků práce druhého giganta na poli genomiky, mezinárodního konsorcia Human Genome Project. Každou noc zveřejňovali vědci z Human Genome Project výsledky toho, na co přes den přišli. Genetici z Celery byli jedni z prvních, kdo se nově zveřejněnými daty důkladně „prohrabali“.
Něco podobného je v proteomice jen ztěží možné. Výsledky analýz prováděných rozdílnými metodami detekce bílkovin lze jen obtížně porovnávat a kombinovat. Pestrá paleta technik přitom není důsledkem rozmarů vědců. Bílkoviny jsou natolik rozličné, že je všechny nelze hledat a zkoumat stejnými prostředky.
Právě proto je pro proteomiku typický stav označovaný někdy jako „balkanizace“. Každá skupina výzkumníků si hraje do značné míry na svém vlastním písečku. Styčné plochy mezi oblastmi výzkumu pokrytých různými týmy jsou spíše výjimkou. Některé týmy se soustředí na porovnávání bílkovin přítomných ve zdravých a nemocných tkáních. Jiné dávají přednost studiu otázek vzájemných interakcí jednotlivých bílkovin. Další týmy vidí jako nejdůležitější studium trojrozměrné struktury bílkovin. Pole proteomiky je tak rozlehlé, že se v něm zatím stačí „utopit“ všichni, kdo se do výzkumu bílkovin pustili.


Složitost výzkumu bílkovin vynikne při pohledu na tento prostorový model.


Na startu byl Human Genome Project
V počátcích výzkumu bílkovin nikoho ani nenapadlo zabývat se bílkovinami v celé šíři spektra jejich rozmanitosti. Vědci studovali bílkoviny hezky pomalu jednu po druhé. Skutečný zlom nastal teprve poté, co mezinárodní konsorcium Human Genome Project začalo uveřejňovat obrovský objem dat o lidské dědičné informaci a poté, co se dramaticky zvýšila výkonnost počítačů a objevily se zcela nové počítačové programy umožňující „lov“ v nepřeberných kvantech dat o lidském genomu. Najednou nebyl velký problém vyhledat kompletní geny pro jakoukoli bílkovinu lidského těla. Stačilo k tomu jen málo. Vědci zjistili pořadí aminokyselin v části bílkovinného řetězce a z něj pak odvodili pořadí písmen genetického kódu, podle kterého byl daný zlomek bílkoviny vyroben. Písmena genetického kódu v daném pořadí pak hledal speciální počítačový program v databázi výsledků čtení dědičné informace. Když počítačový program našel hledanou sekvenci, bylo jasné, že okolní písmena genetického kódu tvoří základ příslušného genu. Podle typických známek už vědci poznali, kde příslušný gen začíná a kde končí. Dokázali zpětně odvodit pořadí aminokyselin ve zbývajících částech bílkovinného řetězce a mnohdy z nich mohli dokonce usuzovat na jejich funkce. Některé typické části předurčují bílkovinu například k vazbě na dědičnou informaci, jiné jí dodávají schopnost opustit nitro buňky.Díky tomu mohou dnes vědci z jediného vzorku tkáně získat informace o statisících různých bílkovinných molekul a to během neuvěřitelně krátké doby několika měsíců.
Počet bílkovin, které se ukazují jako slibný cíl pro nově vyvíjené léky se začal v důsledku tohoto zcela nového přístupu rychle rozrůstat.
Farmaceutický průmysl doposud pátral po nových lécích mezi zhruba pěti stovkami slibných bílkovin odhalených klasickými postupy. Proteomika nabízí pro vývoj nových léků zhruba 10 000 až 20 000 slibných cílů. To je velikost pole, na němž dnes probíhá nemilosrdný závod mezi jednotlivými konkurenty.
Někteří odborníci ale zdůrazňují, že vývoj nových léků není zdaleka limitován nedostatkem vhodných „cílových“ bílkovin. Hlavním problémem je konstrukce molekul, které jsou schopné vstoupit s „cílovou“ bílkovinou do žádaných interakcí. Vítěze závodu, na jehož konci mají být nové léky a s nimi i příslušné zisky, nemusí být zdaleka ten, kdo najde nejvíce slibných bílkovin. Pole proteomiky je zasaženo stejnou zlatou horečkou stejně jako zlatonosná pole Klondiku. Mnohé firmy se doslova „řítí“ proteomem a nechávají si patentovat vše, nač narazí. Podobají se zlatokopům, kteří zabírají stále nové a nové klajmy a nemají čas, ani energii na to, aby na zabraných dílech zkusili na rýžovací pánvi oddělit hlušinu od cenného kovu. Není výjimkou, když jediná firma podá během jednoho roku 4000 patentových přihlášek na jednotlivé bílkoviny. S vysokou pravděpodobností jsou mezi nimi i bílkoviny, na které vznesly patentovými přihláškami nárok jiné firmy. S každou novou přihláškou stoupá riziko zdlouhavých a složitých soudních sporů o to, kdo má na patentovanou bílkovinu skutečně nezadatelné právo.

Tři základní metody
Proteomické firmy využívají při lovu na bílkoviny tři základní postupy. V zásadě není ani jeden z nich nový. První z tria metod označovaná jako dvoudimenzní gelová elektroforéza slouží k oddělení jednotlivých proteinů ze „směsky“ získané z buněk. Vzorek směsi bílkovin je vložen na zvláštní gel. V něm se jednotlivé bílkoviny pohybují různou rychlostí v závislosti jednak na elektrickém náboji, který molekuly nesou, a jednak na velikosti jejich vlastní molekuly. Bílkoviny vytvoří na ploše gelu „pole“ skvrn a teček. Každý „flíček“ představuje bílkovinu s určitým nábojem a o určité velikosti. S vysokou pravděpodobností se v této „skvrnce“ nachází jen jeden jediný typ bílkovinné molekuly. „Flíček“ je možné z gelu vyříznout a bílkovinu z něj izolovat. Následně je bílkovina rozložena na jednotlivé kusy, je stanovena jejich velikost a tím je i předběžně určen druh bílkovinné molekuly.


Ukázka dělení proteinů elektroforézou

Na poli „přesévání bílkovinných směsek“ se v poslední době dějí velké věci. Například přední farmakologická firma Novartis se spojila se soukromou proteomickou švýcarskou firmou GeneProt a ta pro farmaceutického giganta loví slibné bílkovinné molekuly. Novartis přispěl na tento „laboratorní hon“ částkou 43 milionů amerických dolarů. Pokud bude „úlovek“ slušný, může se GeneProt těšit na dalších 41 milionů dolarů. Ještě ambicióznější projekt se odehrává v laboratořích proteomické firmy Large Scale Biology. Tam vzniká databáze lidských bílkovin označovaná jako „Human Protein Index“. Její kompletace je označována za „proteomickou obdobu Human Genome Project“. Přirovnání zjevně příliš nepokulhává za pravdou.

Druhá technika je využívána pro sledování vzájemných interakcí bílkovinných molekul. Vědci pro tyto účely využívají genů, které v živých organismech kódují jednotlivé bílkoviny. Do buněk kvasinek vpraví geny pro dvojici bílkovin, které jsou v podezření, že se spolu v buňkách spojují do jednoho funkčního celku. Bílkoviny kódované těmito geny si můžeme představit jako „lovce“ a „kořist“. Každý z genů je spojen s genem pro jednu polovinu bílkoviny sloužící jako „spouštěč“ genu zodpovědného v kvasince za změnu barvy. Tento „spouštěč“ funguje pouze v případě, že se jeho dvě poloviny dostanou do těsné blízkosti a navzájem se spojí. Pokud se bílkovinný „lovec“ skutečně spojuje s bílkovinnou „kořistí“, pak se jejich spojením dostanou do těsného sousedství i obě poloviny bílkovinného „spouštěče“. Tím je vyvolána barevná změna kvasinek. Pokud nemá bílkovinný „lovec“ o bílkovinnou „kořist“ zájem, pak zůstanou poloviny „spouštěče“ odděleny a kvasinky svou barvu nezmění.
Také tento přístup hltá v současné době desítky milionů od soukromých investorů. Například firma Myriad Genetics z amerického Salt Lake City se spojila s další proteomickou firmou Oracle a s elektronickým japonským gigantem Hitachi a za 185 milionů dolarů hodlá během tří let vytvořit „mapu lidského proteomu“. Podle představitelů firmy Myriad Genetics je tento projekt jedním největších vkladů do budoucího vývoje nových léků. Třetí technika se opírá o metodu rentgenové krystalografie a pomáhá vědcům odhalit detaily stavby jednotlivých bílkovinných molekul. Pro tyto účely je zapotřebí získat bílkovinu v dostatečném množství ve zcela čistém stavu bez jakýchkoli příměsí. Potom jsou ponechány molekuly bílkoviny v podmínkách, v kterých se mohou uspořádat do krystalů. Rentgenový paprsek procházející krystalem se ohýbá na atomech a kreslí na stínítku složitý vzor. Z tohoto vzoru lze usoudit na prostorové uspořádání bílkovinného krystalu a tudíž i na prostorovou stavbu bílkovinné molekuly.


Zdroj rentgenové záření pro krystalografii proteinů.




Krystal proteinu- tento byl připraven při experimentech na palubě raketoplánu a rostl proto nerušeně v podmínkách mikrogravitace.

 
Krystalogram proteinu

Za posledních 40 let se tímto způsobem podařilo odhalit strukturu zhruba dvou tisíc bílkovin. Ty se dnes nacházejí ve veřejně přístupných databázích. Americká soukromá proteomická firma Structural GenomiX z kalifornského San Diega ale slibuje, že vlastními silami zvýší počet prostorových modelů bílkovinných molekul na dvojnásobek a to za pouhých pět let.
Projekty využívající rentgenovou krystalografii pro určení prostorové struktury bílkovin spolkly v letech 1999 až 2001 zhruba půl miliardy dolarů. Polovinu této částky pohltil výzkum financovaný ze státních zdrojů v USA, Japonsku a západní Evropě. Druhou polovinu „nasypaly“ do tohoto perspektivního oboru soukromí investoři. Právě díky penězům ze soukromé sféry mohly odstartovat svou kariéru americké soukromé proteomické firmy, jako je již zmíněná Structural GenomiX nebo její rival Syrrx. Ve Velké Británii vznikla neméně nadějná soukromá firma Astex Technology.

Redukovaný přístup
Prohlášení pro tiskové agentury je jedna věc a skutečný běh v laboratořích zase věc druhá. Zdaleka ne všechny sliby a proklamace se daří naplnit. Firmy se často soustředí na „vyzobávání rozinek“ - tedy na studium nejlukrativnějších problémů, jejichž řešení slibuje bezprostřední finanční efekt v příjmech za patenty na nové léky. Méně slibné oblasti výzkumu zcela vědomě opomíjejí.
Firma Myriad Genetics například přiznává, že zdaleka nesleduje všechny interakce mezi lidskými bílkovinami. Databáze budovaná firmou Large Scale Biology rovněž nepokryje celý lidský proteom. Firma se soustředí se přednostně na ty tkáně, kde je největší naděje na nález bílkovin zajímavých z farmakologického a především obchodního hlediska.


Jedním z proteinů, který k sobě láká v poslední době velkou pozornost je infekční proteinová částice zvaní prion, která je původcem neurodegenerativních chorob ze skupiny spongiformních encefalopatií

Abychom nebyli k proteomickým firmám nespravedliví, musíme uznat, že jejich „redukovaný“ přístup k řešení problémů proteomiky nevyplývá jen ze zištnosti. Jedním z významných faktorů jsou nedostatky stávajících technik využívaných ke studiu bílkovinných molekul. Například dělení bílkoviny na gelech neodvádí nejlepší práci v případě velmi malých nebo naopak obrovských bílkovinných molekul. Velké potíže nastávají také s izolací bílkovin, které „vězí“ v membránách buněk. Bohužel, právě bílkoviny trčící z buněčných membrán se jeví z hlediska farmaceutického průmyslu jako jedny z nejslibnějších. Tato technika také často propásne bílkoviny, které se nacházejí ve vzorcích v nepatrném množství. Význam těchto bílkovinných „špetek“ ale může být zásadní. I malé množství bílkoviny může rozhodovat o zdraví nebo nemoci a může odlišovat například zdravé buňky od buněk, jež jsou předurčeny k rakovinnému bujení.
Ani technika, při níž se zkouší vzájemné propojení bílkovinné „kořisti“ a bílkovinného „lovce“ v buňkách kvasinek, není bez slabin. Může například odhalit interakce dvou bílkovin uvnitř kvasinky, ale v lidských buňkách se tyto bílkoviny vůbec nemusejí potkávat, protože jedna z nich je uvnitř buněk, zatímco druhá se objevuje jen mimo buňky. Vzájemná interakce takových bílkovin je zajímavá z teoretického hlediska, ale pro praktické využití nemá velký význam. Navíc jsou množství jednotlivých bílkovin i schopnost jejich vzájemných vazeb poplatné momentální situaci v buňce a podléhají rychlých a zásadním změnám. Hlavní slabinu studia prostorového uspořádání bílkovinných molekul metodou krystalové rentgenografie představuje rychlost. I když jsou nasazeny pro přípravu vzorků a jejich následné analýzy rentgenovou krystalografií ty nejvýkonnější automaty a laboratorní roboti, nedokáže jedna laboratoř ročně stanovit strukturu více než několika stovek bílkovinných molekul. Výzkum proteomu se s využitím těchto technik nápadně podobá přelévání moře polévkovou lžící. Ani jedna z technik přitom není schopna podchytit další závažné změny, které se odehrávají po syntéze bílkovinného řetězce z aminokyselin. Hotový bílkovinný řetězce podléhá v živém organismu dalším biochemickým změnám. Jsou na něj vázány fosfátové, acetylové, síranové a další chemické zbytky. Tím se vlastnosti bílkoviny významně mění. Poznání těchto „kosmetických změn“ na bílkovinných molekulách je ale nesmírně náročné. Vědcům k tomu chybí potřebné techniky. To se ale může rychle změnit. Pod tlakem honu na nové slibné proteiny je do vývoje nového laboratorního vybavení investováno obrovské množství prostředků a to začíná přinášet ovoce. „Technické vybavení se za každý rok desetkrát vylepší,“ říká Matthias Mann, vedoucí vědecký pracovník kanadské proteomické firmy MDS Proteomics.
Mohlo by se zdát, že tam, kde mají „tvrdě našlápnuto“ soukromé společnosti, se dostávají státní akademické instituce (university nebo státem zřizované ústavy) do role hráčů na druhé housle. Není to ale úplně pravda. Zatímco při čtení lidského genomu dokázala jediná soukromá firma Celera Genomics konkurovat mezinárodnímu sdružení akademických institucí, v případě proteomu nic podobného nehrozí. Možnosti soukromých firem jsou omezené. K poznání proteomu člověka povede zřejmě útok na více frontách a akademickým institucím tu bude patřit významné místo. Už proto, že jsou schopny sdružit své kapacity i duševní potenciál způsobem, jaký nepřipadá u soukromých firem v úvahu. V roce 2001 byl zahájen projekt Alliance for Cell Signaling (ACS). V jeho čele stojí Alfred G. Gilman ze Southwestern Medical Center při University of Texas v Dallasu. Spolu s Gilmanem se v ACS sešlo více než 50 odborníků z 21 institucí. Toto vědecké konsorcium si vytýčilo dva obrovské cíle. Chce poznat proteiny, které se podílejí za řízení dějů v bílých krvinkách produkujících protilátky (tzv. B-lymfocytech) a v buňkách srdečního svalu. Není to sice „čistá proteomika“, protože vědci nezkoumají všechny bílkoviny, které se v těchto typech buněk nacházejí, ale je to nesporně ambiciózní cíl a navíc je uskutečnitelný silami akademických institucí.
Projekt ACS se stal inspirací pro řadu dalších výzkumných týmů. Pro mnohé je jednou z hlavních motivací snaha urvat z pomyslného bochníku proteomiky pořádný kus, který by neskončil na patentových listinách soukromých firem. Pokud akademické instituce získají významné poznatky o důležitých bílkovinách, nebudou si moci soukromé firmy tyto informace patentovat a ty pak budou volně dostupné všem.