Adeno-asociované viry (AAV) jsou jednovláknové DNA částice obalené proteinovou kapsidou, které se normálně replikují za pomoci jiných virů (helper viry- např. adenovirus, herpesvirus). Otázka jejich patogenity je sporná, avšak pro všeobecný nedostatek důkazů jsou považovány za neškodné a podle různých zdrojů je jimi v součastnosti nakaženo 70 – 90 % světové lidské populace.
Tyto viry jsou v poslední době ve středu zájmů vědců zabývajících se genovou terapií, kteří je hodlají využít jako možné vektory pro přenášení genetické informace.
AAV se během svého životního cyklu zabudovávají do lidské DNA a tudíž by do ní mohli vkládat i informaci vytvořenou člověkem.
Imunitní systém člověka, tyto viry dosti úspěšně neutralizuje, čímž zabraňuje i možné genové terapii. David Schaffer, docent na UC Berkely, se spolu se svými kolegy rozhodli tento virus vylepšit. V podstatě šlo o to dosáhnout toho, aby se virus lépe množil a naše tělo se proti němu nedokázalo účinně bránit. Použili k tomu nástroj hodný samotné matky přírody - evoluci. Přesněji řečeno urychlenou evoluci v laboratorních podmínkách.
Do této doby byla takzvaná řízená evoluce využívána hlavně ke zvýšení aktivity enzymů, nebo k tvorbě účinnějších protilátek proti specifickému antigenu. Ve virové říši se dosud nepoužívala.
AAV obsahují ve svém obalu dva strukturní geny. Jeden řídí replikaci a integraci do hostitelského genomu a druhý tvorbu virového pláště. Proteiny, které tvoří plášť viru (kapsidu) jsou struktury, které náš imunitní systém rozeznává a bojuje proti nim svými protilátkami. Proto se výzkumníci zaměřili právě na ně, přesněji na gen, který odpovídá za jejich tvorbu.
Nejprve šlo o to získat dostatečnou genetickou variabilitu viru aby jej pak mohli podrobit selekci. K tomu vědci použili techniku, která umožňuje při kopírování genetického kódu vznik chyb. Pro tuto techniku se používá anglický termín „error-prone PCR“ (česky něco jako k chybám náchylná polymerázová řetězová reakce). Při této reakci kopie vznikající nukleové kyseliny nejsou zcela identické s předlohou. Tím se stává, že v některých místech genu vzniklé kopie kódují odlišné aminokyseliny. Zmíněnou techniku umožňující vznik chyb aplikovali na gen kódující plášťový protein. To znamená, že izolovali z virové nukleové kyseliny tento gen a pak jej podrobili výše zmíněné technice „chybové replikace“. Tímto způsobem vědci získali mnoho variant jednoho genu, který později ovlivní podobu pláště viru.
A na tuto metodu pak navazovala rekombinace DNA in vitro, kdy pozměněné řetězce byly vneseny pomocí enzymů do virové DNA. Vektorová (virová) DNA je v určitém místě rozštěpena enzymem restrikční endonukleázou a cizí, nebo v tomto případě pozměněná část řetězce se do ní uzavře pomocí jiného enzymu ligázy tak, že vznikne nová rekombinantní molekula DNA. Ta pak za přítomnosti aminokyselin a nezbytných enzymů řídí celou stavbu virové částice.
Když měli vědci k dispozici sadu nově připravených virů, přidali k nim krevní sérum z králíků, kteří se již setkali s divokým typem viru a v jejichž krvi proti němu kolovaly protilátky. Protilátky způsobily to, že přežily jen ty nejsilnější, nejlépe přizpůsobené (mutované) viry. Roli v tom hrál pouze přírodní výběr, neboť mutací vznikly náhodné změny – tedy jak ty výhodné pro přežití v prostředí protilátek, tak i ty s nevýhodnými změnami, které účinek protilátek vyřadil. To, které přežily záviselo na schopnosti nově vyvinutých forem vyhnout se vazbě s protilátkou.
Přežívající viry vědci izolovali a znovu na nich nechali „vyřádit“ chybující metodu množení, aby dosáhli ještě většího počtu mutací. Postup se opakoval a při každém selektivním výběru zvyšovali dávku protilátek. Tím se stalo, že nevýhodné mutace „odpadly“ a zůstali AAV „superviry“. Darwin by zaplesal. Takto dvakrát pozměněný virus přežil v pokusných myších tisící násobek dávky protilátek Ne to není překlep, k eliminaci těchto virů bylo třeba dodat myši 1000x více protilátek, než kolik jich stačilo k ochraně před divokým typem viru. Tým Berkeleyské univerzity toto vše zvládl za 2 měsíce.
Ve zmutovaných virech, které se podařilo v tomto pokusu vyrobit, bylo zjištěno 7 změněných aminokyselin, z nichž dvě výrazně znemožňovaly interakci plášťových proteinů s protilátkami. Docent Schaffer hodlá v nejbližších měsících vytvořit ještě účinnější generace AAV a také začít s pokusy s lidským sérem. Vznik AAV odolných proti lidským protilátkám by mohl přinést zvrat v dosud používané genové terapii, jejíž dosavadní výsledky jsou dosti rozporuplné.
Genová terapie je možným východiskem v léčbě takových nemocí jako je dědičná imunitní nedostatečnost, Alzheimerova a Parkinsonova choroba, nebo některé druhy zhoubných nádorů.
Uvedená metoda je v principu použitelná i pro většinu jiných druhů virů a představa, že by ji někdo použil, například na virus pravých neštovic, je úděsná. David Schaffer se dokonce nechal slyšet, že existují i jiné a jednoduší metody, kterými lze zde popsaného efektu dosáhnout....
Prameny: University of California Berkeley
Journal of Virology
Journal of Theoretical Biology 234 (2005) 497–509)
základní charakteristika AAV
Diskuze:
