Potřebných nového orgánu je více než dárců. S nástupem dovolených se šance čekatelům, že obdrží SMS zprávu, aby se okamžitě dostavili do transplant centra o něco zvyšuje, ale ne o tolik, o kolik by si přáli. Kompatibilního dárce od příjemce často dělí tisíce kilometrů a tak se to neobejde bez závodu s časem. Do akce pak vyráží sanitky, letadla a na pracoviště jsou sváženi specialisté. To vše kvůli tomu, že o úspěšnosti zákroku rozhoduje, jak rychle se podaří orgán do nového organismu přenést. Veškerému takovému kvaltování by mohl být brzo konec. Teda pokud by se podařilo orgány uchovat funkční po dlouhou dobu. A že se o to snaží kryokonzervační týmy po celém světě, je nabíledni. Žádnému se ale zatím moc nedařilo, a proto zájem o tento výzkum do značné míry upadal. Naštěstí ne na University of Minnesota. Jejich nynější úspěch v podobě „zmrazené ledviny“ obletěl svět. Paradoxem na tom je, že i když se všude píše o úspěchu ve zmrazování, ve skutečnosti jde o jeho pravý opak.

Ve zmrazování problém nebyl a není

Schema pokusu

1) Operativní vyjmutí ledviny. 2) promytí ledviny kryoprotektivem s přídavkem nanočástic oxidu železa. 3) Rychlé ochlazení při němž voda netvoří krystaly, ale sklu podobnou amorfní strukturu. 4) Dlouhodobé uchování při teplotě mínus 150 stupňů Celsia do doby, než se objeví potřebný příjemce. 5) Rychlý rovnoměrný radiofrekvenční ohřev. 6) a 7) Vymytí kryoprotektiv s nanočástečkami a transplantace ledviny potkanovi, kterému jeho vlastní orgán byl odstraněn. Přežití zvířete je dokladem funkčnosti zmrazeného a rozmrazeného orgánu. (Kredit: Zonghu Han et al.: Nature Communication 14, 2023)

Navzdory všeobecným představám buňkám mráz nevadí. Ani ten stovky stupňů Celsia pod nulou. Mrazit buňky umíme už dlouho a rutinně se to dělá u spermií, vajíček i celých embryí. Stejnou techniku použili i vědci v Minnesotě. Problém, s kterým se vědci potýkali, byl v něčem jiném. Vysvětlíme si to na tom, kde to všechno začalo – u spermií. Spermie je v podstatě jen takový suchý pytlíček napěchovaný deoxyribonukleovou kyselinou. Vody náchylné dát vznik ledovým krystalům, je v něm poskrovnu. Proto spermiím zmrazování nečiní větší problém.

V případě vaječných buněk, zygot a embryí, které již uchovat v kapalném dusíku také dovedeme, jde už o zcela jinou ligu. Ohledně vody se podobají melounům. A podobně jako v těch s klesající teplotou voda tuhne do „ledovců“ a ty drtí vše, co jim stojí v cestě. Krystalky ledu trhají jemné organely v cytoplazmě na kusy, což životu nedává sebemenší šanci. A kdyby jen to. Jakmile je voda vázána do struktury zvané led, stoupne v buňce osmolalita. Cytoplazma se prakticky vysušuje, mění se pH, roste koncentrace enzymů a tak některé biochemické reakce se urychlí, jiné zase zatuhnou, protože se jim změnil poměr substrát/enzym.

Naštěstí se našel způsob, jak škodám předcházet. Růst krystalů do obřích rozměrů se dá částečně omezit rychlým podchlazením. Krystaly pak vyrostou malé a malé krystaly páchají menší škody. Hlavně se ale při zmrazování používají látky nazývané kryoprotektanty. Všichni víme, že alkohol hned tak nezmrzne. Proto se někdy jako kryoprotektivní látky do zmrazovacího média přidávají propandiol, glycerol, etylenglykol,… Podobně jako přídavek alkoholu blahodárně účinkuje i obyčejná sacharóza, nebo některý z proteinů, které si za tím účelem umí vyrábět ryby žijící v podchlazené slané vodě Arktidy a Antarktidy.

Nejoblíbenějším lektvarem, který byl použit i v pokusu, o němž je tento článek, je chemikálie přezdívaná DMSO. Jde o vžitou zkratku pro dimetylsulfoxid. Jeho přidání do media razantně snižuje bod tuhnutí a zvětšuje podíl nezmrzlé kapaliny i při teplotách pod bodem tuhnutí. Bylo by nošením dříví do lesa rozebírat, že tím omezuje nadměrnou dehydrataci a nárůst koncentrace přítomných solí.

Zonghu Han, první autor studie. Institute for Engineering in Medicine. Kredit: University of Minnesota

Sluší se ale ještě zmínit prospěšnost dalších látek přidávaných do mrazících medií - dextran a polyvinylpyrolidin. Jejich molekuly jsou tak velké, že nemají šanci se do buněk dostat. Přesto je jejich úloha v procesu zmrazování neocenitelná. Brání tvorbě nukleačních center a omezují růst ledových krystalů v okolí buněk. To je zvláště u tkání důležité. I krystaly vznikající v mezibuněčných prostorách se ke svému okolí umí zachovat jako ledová kra k Titaniku.

Američtí vědci (prvním autorem je Číňan) ve své publikaci z tohoto týdne píší o vitrifikaci. Mají tím na mysli jen to, že prováděli rychlé zmrazení v řádu sekund za použití kryoprotektiva DMSO. Fyzikálně jde o sklovité zpevnění vodného roztoku s extrémním zvýšením viskozity. Neboli o tvorbu amorfní formy ledu, který buňku a tkáň mechanicky tolik nepoškozuje. Pochopitelně, že ostatní nectnosti připadající na vrub použití DMSO zůstaly, takže po rozmrazení bylo třeba se jeho jedovatosti co nejrychleji zbavit. DMSO je chemicky mocné agens rozpouštějící kde co. Zvládá ničit polární i nepolární molekuly a v poslední době se stále častěji objevuje rozšíření jeho záběru o genotoxicitu. Nemile překvapila jeho toxicita i britské očaře. V téměř stokrát nižších koncentracích (než jaké se používají při zmrazování buněk) buňkám očního nervu enormně škodí. Stačí jedno hmotnostní procento a spolehlivě neuronům startuje apoptózu s následkem smrti. Naštěstí v ledvinách tolik nervů není, anebo tam nejsou tak citlivé jako ty v oku, a tak DMSO lze při jejich zmrazování použít. Jedovatost použité substance tu zmiňujeme proto, že doba, po kterou se mu při rozmrazování dovolilo páchat zlo, hrála v nynějším objevu rozhodující roli.

To, čím se kolektivu vědců od Hořejšího jezera podařilo všem ostatním vypálit rybník je způsob rozmrazování tkáně. Je to proces pro buňky mnohem bolestivější, než jakým je zmrazování. Snaha rozmrazit tkáň rychle, si vynucuje použití roztoků o vyšší teplotě, než když se rozmrazují jednotlivé buňky, anebo jen malé shluky buněk v případě embryí. Vyšší teplota se buňkám nelíbí a hynou na tepelný šok. Když se proces rozmrazování protáhne, tak buňky pro změnu otráví jedovaté DMSO. A i když se postupuje šetrně, sklovitý amorfní led se přeměňuje v kapalinu nerovnoměrně. To vede k tomu, že lokálně dochází ke zvyšování koncentrace kryoprotektiva, případně se místně nakrátko tvoří z amorfního led krystalický, což šance na přežití buněk také nezvyšuje. Tristní situaci lze popsat tak, že co se na začátku zmrazování podařilo, rozmrazovací konec zatím vždy pohnojil.

Že se tyto nesnáze staly minulostí je zásluhou magnetického pole a nanočásteček oxidu železa, které vědci přimíchali do roztoku DMSO a kterýmžto roztokem ledvinu před zmrazením napumpovali. V podstatě tedy jen „maličkost“ nyní dovoluje proces rozmrazování rapidně zkrátit. Rychlé prohřátí omezilo krystalizaci, a jak se ukázalo, tak v porovnání s dobou optimální pro zmrazení, je rozmrazování nutné provést o řád razantněji (10–1000 s °C/min versus 1–100 s °C/min).

Když to shrneme, tak se nyní vědcům podařilo na kost zmrzlou ledvinu přivést do životaschopného stavu vhodného k transplantaci pomocí střídavého magnetického pole. To generovalo oscilační odezvu v nanočásticích a produkci tepla. Takto provedené rozmrazení je nejen rychlé, ale především v celém orgánu rovnoměrné. To následně umožní mnohem rychleji přistoupit k vymývání jedovatých kryoprotektiv, bez nichž se při zmrazování zatím obejít neumíme.

I když byl pokus uskutečněn na potkanech, které mají ledviny titěrné, vědci v publikaci zmiňují, že jejich technika je škálovatelná na orgány o velikosti těch lidských. Nejspíš se tedy stáváme svědky převratného způsobu dlouhodobého uchování orgánů s možností dělání jejich zásob. To by mělo učinit transplantace nejen dostupnější, ale i levnější. A nemuselo by jít jen o ledviny...

Literatura

Zonghu Han et al, Vitrification and nanowarming enable long-term organ cryopreservation and life-sustaining kidney transplantation in a rat model, Nature Communications (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-38824-8