Po přednášce k Nobelově ceně za medicínu a fyziologii. Na snímku z Auly Medica v Karolinska Institutet ze dne 7. prosince 2014 trojice laureátů (zleva): John O'Keefe, May-Britt Moserová a Edvard Moser Kredit: Wikipedia, Gunnar K. Hansen NTNU, CC 2.0

Odhalovat tajemství fungování mozku, řídícího centra těla, orgánu, jenž odpovídá za naše já, je vzrušující, náročné, ale omezené mnohými limity. Vzorky již neaktivního, mrtvého mozku pod mikroskopem sice odpoví na mnohé otázky o struktuře, poruchách či patologických změnách spojených s věkem a nemocemi, ale jen málo prozradí o činnosti živé nervové tkáně. Neinvazivní metody pomocí „čepice“ se snímacími elektrodami nebo zobrazovací metoda magnetické rezonance pomohou odhalit oblasti s největší aktivitou, ale člověk zvídavý chce poznat aktivitu jednotlivých neuronů a jejich doslova orchestrální spolupráci, když mozek řídí běžnou činnost nebo řeší nějaký problém. K tomu je, zatím, zapotřebí sáhnout k invazivním metodám, a tím pádem i k laboratorním hlodavcům, jenž na oltář vědy kladou nedobrovolnou oběť. Přestože jejich mozečky jsou nepoměrně menší a jednodušší než ty naše, jsou důležitými výzkumnými objekty. I pro neurobiology.

Velmi zajímavou metodou, kterou je možné sledovat aktivitu jednotlivých neuronů, je zobrazování iontů vápníku. Jejich hladina totiž přímo úměrně závisí od intenzity činnosti (nejen) mozkových buněk. Jak to ale snímat? In vitro, v tkáňové kultuře, ale také in vivo, v hlavě živého tvora – například v mozkové kůře pokusné myšky? Řešením je fluorescenční chemikálie (pro výzkum in vitro), nebo fluorescenční protein (pro studium in vivo). Když se naváže na iont vápníku, znásobí své fluorescenční schopnosti a zviditelní příslušnou makající buňku. Aby vůbec zazářil, musí být vybuzen fotony světla určité vlnové délky.

Mini2P z blízka. Kredit: Kavli Institute for Systems Neuroscience/NTNU

Předtím však fluorescenční protein musí v buňce být. Jak se do ní dostane? Vyrábí si ho sama podle návodu. U laboratorních, geneticky modifikovaných myší může jít o cíleně chovanou linii jedinců, jejichž buňky už od narození protein produkují podle genu včleněného do jaderné DNA, kterou dědí. Příslušný genetický recept pro fluorescenční bílkovinu lze však vpašovat cíleně jen do buněk tkáně ve sledované oblasti nějakého orgánu pomocí injekce s upraveným virem. Podobně, jako proticovidové vektorové vakcíny pomocí pozměněného adenoviru do buněk svalové tkáně propašují sekvenci DNA pro výrobu proteinu spike (např. vakcíny Astra Zeneca, Sputnik V).

Trojice, která je „srdcem“ výzkumného týmu, který sestrojil a zdokonal mikroskop Mini2P: Nositelé Nobelovy ceny Edvard Moser (vlevo) a jeho manželka May-Britt Moserová (vpravo) šéfují Kavlimu institutu pro systémovou neurovědu Norské univerzity vědy a techniky (NTNU). Jejich mladý kolega, Weijian Zong (uprostřed) vedl projekt vývoje přístroje. Kredit: Kavli Institute for Systems Neuroscience/NTNU

Takže živé, zdravé myšky, u nichž aktivitu mozkových buněk pomocí vápníku lze sledovat, bychom už měli. Potřebujeme ale vhodné zařízení, které fluorescenci vybudí a bude časo-prostorovou lokalizaci záblesků aktivních neuronů co nejpřesněji snímat. I s touto výzvou se vědci popasovali a navrhli již celou řadu malých zařízení. S miniaturním, necelé 3 gramy vážícím implantátem, který se upevní do lebky na temenu pokusné myšky a pak monitoruje práci jednotlivých neuronů v mozkové kůře, přišli vědci z Kavliho institutu pro systémovou neurovědu Norské university pro vědu a techniku.

Týmu, jemuž velí manželská dvojice, oba laureáti Nobelovy ceny za medicínu a fyziologii za rok 2014, May-Britt Moserová a Edvard I. Moser (třetím oceněným byl John O'Keef) se podařilo technicky zdokonalit, zmenšit a odlehčit prototyp, který jejich laboratoř před asi dvěma lety vyvinula. Nový dvoufotonový mikroskop – Mini2P umožňuje vícevrstevné plošné zobrazování tisíců neuronů v kortexu volně se pohybující myši. „Volně“ samozřejmě myšleno v rámci laboratorního, 80x80x80 cm velkého testovacího boxu. Pokusné myšky si na implantát musely nějaký ten den zvykat, ale porovnávací testy prokázaly, že pak se i s lehkou přístrojovou „korunkou“ opatřenou jemnými, velmi flexibilními optickými vlákny chovaly zcela přirozeně.

Miniaturním mikroskopem Mini2P lze pomocí regulovatelné čočky snímat různé roviny v různých hloubkách zorného pole pod přístrojem, což umožňuje vytvořit 3D obraz neurální aktivity v dané oblasti mozkové kůry. Kredit: Weijian Zong et al.: Resource Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice; Cell 2022 https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.017

Jak Mini2P pracuje? Podrobný popis i s výsledky experimentů je obsahem odborného článku, který zveřejnil jeden z nejprestižnějších biologických časopisů Cell a zpřístupnil ho bez omezení. Proto jenom pro rámcovou představu uveďme, že příliv iontů vápníku v aktivních neuronech se projeví výrazně zvýšenou fluorescencí na ně se vázající bílkoviny. Její excitace vyvolává interference dvou kratičkých femtosekundových laserových pulzů s frekvencí 488 nm. Proto se metoda nazývá dvoufotonová Ca²⁺ mikroskopie. Interference umožňuje použít pro buňku méně nebezpečné laserové světlo s nižší energií a dvojice záblesků, v porovnání s jedním s vyšší energií (920 nm), také zlepšuje rozlišení pozorovaného pole. To je titěrně malé a zabírá plochu asi 0,5 x 0,5 mm. Musíme si však uvědomit, že to, co se v něm sleduje, jsou malé myší neurony o rozměrech mikrometrů. Jenže nejde jen o jednu zobrazovací rovinu. Malý přístroj je, na rozdíl do předcházejícího prototypu, opatřen elektricky ovladatelnou čočkou. Jemná změna jejího zakřivení mění ohniskovou vzdálenost, a s tím se posouvá i zobrazovací rovina v rozsahu 240 μm. Miniskop Mini2P tedy umožňuje, díky snímání různých vrstev do hloubky mozkové kůry, získat 3D obraz tisíců neuronů excitovaných laserovým světlem a shromažďovat značné množství dat v jedné záznamové relaci.

Norským vědcům se  podařilo otevřít okno do živého myšího mozku pracujícího za podmínek pro pokusného hlodavce běžných. Vědci doufají, že pomocí MiniP2 se podaří lépe chápat změny při nemocech mozku. Šéf týmu, profesor Edward Moser: "Víme, že Alzheimerova choroba narušuje schopnost orientace a paměť. Jedná se o mozkové funkce, které se vážou na sehranou spolupráci tisíců mozkových buněk. Mini2P nabízí způsob, jak sledovat změny v dynamice tisíců neuronů u volně se pohybujících jedinců modifikovaných myších kmenů, které jsou modelovými organismy pro studium Alzheimerovy choroby.“

Poznámka na závěr: Vědci z Kavliho institutu se rozhodli svůj Mini2P sdílet jako open source s neurovědci a laboratořemi po celém světě. Plán přístroje, nákupní seznam součástí a instruktážní filmy jsou přístupné prostřednictvím platformy GitHub.

Video: Mini2P je miniaturizovaný mikroskop určený k detailnímu pozorování neurální aktivity v kortexu laboratorní myšky. Kredit: Kavliho institutu pro systémovou neurovědu NTNU

Video2: Jak vyrobit Mini2P – miniaturní dvoufotonový mikroskop pro rychlé zobrazování vápníku. Kredit: Kavliho institutu pro systémovou neurovědu NTNU. Další informace zde.

Literatura: Cell, PhysicsWorld